植物蛋白質提取方法總匯

一、植物組織蛋白質提取方法
　　1、根據樣品重量（1g樣品加入3.5ml提取液，可根據材料不同適當加入），準備提取液放在冰上。
　　2、把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上靜置（3-4小時）。
　　3、用離心機離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
　　4、提取上清液，樣品制備完成。
　　蛋白質提取液：300ml
　　1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml
　　2、甘油（Glycerol）75ml
　　3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g
　　這種方法針對SDS-PAGE，垂直板電泳！
　　
　　二、植物組織蛋白質提取方法
　　氯醋酸—丙酮沉淀法
　　1、在液氮中研磨葉片
　　2、加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過夜，然后離心（4℃8000rpm以上1小時）棄上清。
　　3、加入等體積的冰浴丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇），搖勻后離心（4℃8000rpm以上1小時），然后真空干燥沉淀，備用。
　　4、上樣前加入裂解液，室溫放置30分鐘，使蛋白充分溶于裂解液中，然后離心（15℃8000rpm以上1小時或更長時間以沒有沉淀為標準），可臨時保存在4℃待用。
　　5、用Brandford法定量蛋白，然后可分裝放入-80℃備用。
　　藥品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中（終體積為5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。
　　這種方法針對雙向電泳，雜質少，離子濃度小的特點！當然單向電泳也同樣適用，只是電泳的條帶會減少！
　　
　　三、組織：腸黏膜
　　目的：WESTERN BLOT檢測凋亡相關蛋白的表達
　　應用TRIPURE提取蛋白質步驟：
　　含蛋白質上清液中加入異丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）
　　倒轉混勻，置室溫10min
　　離心：12000 g，10min，4度，棄上清
　　加入0.3M鹽酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）
　　振蕩，置室溫20min
　　離心： 7500g，5 min，4度，棄上清
　　重復0.3M鹽酸胍/95％乙醇步2次
　　沉淀中加入100％乙醇 2ml
　　充分振蕩混勻，置室溫20 min
　　離心： 7500g，5min，4度，棄上清吹干沉淀
　　1％SDS溶解沉淀
　　離心：10000g，10min，4度
　　取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT）
　　存在的問題：加入1％SDS后沉淀不溶解，還是很大的一塊，4度離心后又多了白色沉定，SDS結晶？測濃度，含量才1mg/ml左右。
　　解決：提蛋白試劑盒，另外組織大小適中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分鐘，效果很好的。
　　
　　四、植物材料：水稻苗，葉鞘，根
　　1、200毫克樣品置于冰上磨碎
　　2、加lysis buffer，離心，10000rpm，4度，5min取上清
　　3、重復離心5min
　　lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40
　　
　　五、蛋白質樣品制備
　　秧苗蛋白質樣品的提取按Davermal等（1986）的方法進行。
　　100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巰基乙醇），混勻，-20℃沉淀1小時，4℃，15000 r/min離心15 min，棄上清，沉淀復溶于1.5ml冷丙酮（含10 mMβ-巰基乙醇），再于-20℃沉淀1小時，同上離心棄上清，（有必要再用80％丙酮（含10 mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干。
　　按每mg干粉加入20μl（可調） UKS液[9.5 M尿素，5mM碳酸鉀，1.25%SDS，0.5%DTT（二硫蘇糖醇），2% Ampholine （Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10），6% Triton X-100]，37℃溫育30min，期間攪動幾次，28度 （溫度低，高濃度的尿素會讓溶液結冰）16000 r/min離心15 min，離心力越大時間長一點越好！上清即可上樣電泳。或者-70度保存
　　
　　六、植物根中蛋白質的抽取
　　（1） sample, 液氮研磨
　　（2） 裝1.5 ml centrifuge 用tube
　　（3） 加 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul
　　（4） 12000 rpm, 4度, 10-15minite
　　（5） 取上層液，蛋白質就在里面